Quel qscore ?

Le Q-score est une métrique qui exprime la qualité d'une lecture de séquence individuelle. Le Q-score est généralement utilisé pour quantifier la confiance que l'on peut avoir dans chaque base appelée lors du séquençage.

DĂ©finition du Q-score

Q-score est une mesure logarithmique de la probabilité d'erreur de basecalling. Plus précisément, un Q-score est défini comme :

Q=−10log10​PQ=−10log 10 ​ P

oĂč 𝑃 est la probabilitĂ© qu'une base appelĂ©e soit incorrecte. Ainsi, un Q-score plus Ă©levĂ© indique une plus grande confiance dans la lecture de la base et vice versa. Par exemple, un Q-score de 20 indique une probabilitĂ© d'erreur de 1 sur 100, tandis qu'un Q-score de 30 indique une probabilitĂ© d'erreur de 1 sur 1000.

Utilisation du Q-score dans Dorado

Dans Dorado, comme dans d'autres outils de basecalling pour le séquençage par nanopores, le Q-score sert à évaluer et à filtrer les lectures en fonction de leur qualité. Dorado permet aux utilisateurs de spécifier un Q-score minimum (--min-qscore) lors du basecalling. Cela permet de filtrer et de ne conserver que les lectures qui atteignent ou dépassent un seuil de qualité spécifique, ce qui est utile pour éliminer les données de faible qualité qui pourraient compromettre les analyses en aval.

Importance du qscore

Filtrage des données

Le filtrage basé sur le Q-score aide à réduire le volume de données à analyser et améliore la précision des analyses en aval, telles que l'assemblage de génomes, l'identification de variants, et d'autres formes d'analyses bioinformatiques.

Comparaison de kits de séquençage

Le Q-score peut Ă©galement ĂȘtre utilisĂ© pour comparer les performances de diffĂ©rents kits de prĂ©paration d'Ă©chantillons ou de conditions expĂ©rimentales, offrant une mesure standardisĂ©e de la qualitĂ© des lectures.

Optimisation des protocoles

En surveillant les Q-scores, les chercheurs peuvent ajuster les protocoles de séquençage pour optimiser la qualité des données produites.

Analyse

Analyse du gÚne TTR à partir d'un amplicon de 1F à 4R (7096 paires de bases). C'est toutes les régions codantes et introns du gÚne TTR (Transthyretin). Ces résultats sont pris de 1 pod5 parmis les 48 (Mingon de nanopore (NATIF)) réalisés avec le modÚle hac@5.0.0 et le kit SQK-NBD114-24. Pour obtenir ces différents résultats nous avons modifié le qscore au moment du basecalling. Toutes ces valeurs nous laissent à penser que le qscore réglé aux alentours des 17 permettent d'avoir des résultats fiables sans perte de profondeur. A voir si celà change sur tout le séquençage (les 48 pod5).

/home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dorado basecaller \
    -x "cuda:0" \
    --min-qscore 7 \
    --no-trim \
    --emit-fastq \
    /home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dna_r10.4.1_e8.2_400bps_hac@v5.0.0
    pod5/ | \
    /home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dorado demux \
    --kit-name SQK-NBD114-24 \
    --emit-fastq \
    --output-dir demultiplexed
DDNN° dossierEchantillonFCilluminaNanoporeProfondeur (x) c.13VAF(%) c.13 C>TProfondeur (x) c.371VAF(%)c.371 G>AilluminaNanoporeProfondeur (x) c.13VAF(%) c.13 C>TProfondeur (x) c.371VAF(%) c.371 G>A

25/12/1945

2023-3726

RB16

FLG-114

RAS

RAS

1750

24

1258

11

Minion

RAS

RAS

16441

11

14670

11

05/11/1942

2024-0849

RB17

FLG-114

RAS

RAS

2683

24

1959

12

Minion

RAS

RAS

27768

12

26159

11

13/11/1962

2024-0851

RB18

FLG-114

POS/c.290C>A

POS/c.290C>A

1563

24

10681

12

Minion

POS/c.290C>A

POS/c.290C>A

11817

11

10202

11

05/01/1947

2024-0882

RB19

FLG-114

RAS

RAS

1313

26

1003

14

Minion

RAS

RAS

10599

11

9934

10

01/11/1948

2024-0869

RB20

FLG-114

RAS

RAS

2085

29

1749

12

Minion

RAS

RAS

23943

13

22449

11

18/08/1984

2024-0325

RB21

FLG-114

POS/c.290C>A

POS/c.290C>A

1556

23

1171

12

Minion

POS/c.290C>A

POS/c.290C>A

15205

10

13343

10

02/04/1970

220691295

RB22

FLG-114

POS/c.424G>A

POS/c.424G>A

1548

29

1374

13

Minion

POS/c.424G>A

POS/c.424G>A

15311

13

15079

11

16/03/1968

203301144

RB23

FLG-114

POS/c.424G>A

POS/c.424G>A

1595

25

1128

10

Minion

POS/c.424G>A

POS/c.424G>A

12567

11

11631

11

qscore 0

BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %

1 POD

null

null

9

690

8

723

8

5

10

666

9

707

7

6

11

927

9

959

9

6

qscore 9 (par défaut)

BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %

1 POD

9

620

6

659

7

4

10

605

6

654

6

5

11

811

7

859

6

5

Tous POD

9

78 264

6

80 084

6

3

10

77 604

6

81 460

6

3

11

91 754

6

94 442

6

4

qscore 14

BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %

1 POD

null

null

9

562

5

589

5

3

10

539

6

585

4

4

11

711

6

770

4

5

Tous POD

null

null

9

69222

5

71956

5

3

10

68312

5

72931

5

3

11

80929

5

84629

5

3

qscore 15

BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %

1 POD

null

null

9

522

5

566

5

3

10

523

6

559

4

4

11

675

6

742

5

4

qscore 17

BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %

1 POD

null

null

9

436

5

465

5

3

10

444

5

455

4

4

11

567

5

619

4

3

Tous POD

null

null

9

55636

5

58835

4

2

10

54870

5

59291

4

2

11

65218

5

69171

4

3

qscore 19

BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %

1 POD

null

null

9

246

4

271

4

3

10

252

6

266

3

2

11

306

4

351

4

4

qscore 24

Il faut savoir que j'ai mis que 3 barcodes dans les tableaux du dessus mais en réalité j'en possÚde de 9 à 17 soit 9. Une fois le qscore passé à 24, j'ai perdu des barecodes et ils n'avaient presque pas de profondeur. Le qscore de 24 est donc trop élevé.

Pour effectuer des tests de qualité, nous pouvons automatiser tout ce processus via un script en .sh. Un point d'entrée de POD5 et on en ressort les BAM qui sont rangé en fonction du barcode et du qscore. 

#!/bin/bash

# Définir le chemin de l'exécutable Dorado
DORADO_BIN="/home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dorado"
MODEL_PATH="/home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dna_r10.4.1_e8.2_400bps_hac@v5.0.0"

# Dossier contenant les données POD5
INPUT_DIR="pod5/"

# Scores de qualité à tester
QS_SCORES=(0 9 14 15 17 19 24)

# Boucle sur chaque score de qualité
for qscore in "${QS_SCORES[@]}"; do
    # Créer un répertoire pour les résultats de ce Q-score
    OUTPUT_DIR="demultiplexed_q${qscore}"
    mkdir -p "${OUTPUT_DIR}"

    # Basecalling et démultiplexage
    $DORADO_BIN basecaller -x "cuda:0" --min-qscore "$qscore" --no-trim --emit-fastq $MODEL_PATH $INPUT_DIR | \
    $DORADO_BIN demux --kit-name SQK-NBD114-24 --emit-fastq --output-dir "${OUTPUT_DIR}"

    # Dossier pour stocker les fichiers BAM
    BAM_DIR="bam_files_q${qscore}"
    mkdir -p "${BAM_DIR}"

    # Convertir chaque fichier FASTQ en BAM
    for fastq in "${OUTPUT_DIR}"/*.fastq; do
        bam_file="${BAM_DIR}/$(basename "${fastq}" .fastq).bam"
        minimap2 -ax map-ont -t 8 ref_genome.mmi "${fastq}" | samtools sort -o "${bam_file}"
    done
done

echo "Basecalling, démultiplexage, et conversion en BAM terminés pour tous les Q-scores."
PreviousBaseCalling Dorado + DemultiplexageNextRĂ©sultats

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