> For the complete documentation index, see [llms.txt](https://aleksandre80.gitbook.io/stage/llms.txt). Markdown versions of documentation pages are available by appending `.md` to page URLs; this page is available as [Markdown](https://aleksandre80.gitbook.io/stage/basecalling-avec-dorado/basecalling-dorado-+-demultiplexage/quel-qscore.md). # Quel qscore ? Le Q-score est une métrique qui exprime la qualité d'une lecture de séquence individuelle. Le Q-score est généralement utilisé pour quantifier la confiance que l'on peut avoir dans chaque base appelée lors du séquençage. ## Définition du Q-score **Q-score** est une mesure logarithmique de la probabilité d'erreur de basecalling. Plus précisément, un Q-score est défini comme : $$ Q=−10log 10 ​ P $$ où 𝑃 est la probabilité qu'une base appelée soit incorrecte. Ainsi, un Q-score plus élevé indique une plus grande confiance dans la lecture de la base et vice versa. Par exemple, un Q-score de 20 indique une probabilité d'erreur de 1 sur 100, tandis qu'un Q-score de 30 indique une probabilité d'erreur de 1 sur 1000. ## Utilisation du Q-score dans Dorado Dans Dorado, comme dans d'autres outils de basecalling pour le séquençage par nanopores, le Q-score sert à évaluer et à filtrer les lectures en fonction de leur qualité. Dorado permet aux utilisateurs de spécifier un Q-score minimum (`--min-qscore`) lors du basecalling. Cela permet de filtrer et de ne conserver que les lectures qui atteignent ou dépassent un seuil de qualité spécifique, ce qui est utile pour éliminer les données de faible qualité qui pourraient compromettre les analyses en aval. ## Importance du qscore ### Filtrage des données Le filtrage basé sur le Q-score aide à réduire le volume de données à analyser et améliore la précision des analyses en aval, telles que l'assemblage de génomes, l'identification de variants, et d'autres formes d'analyses bioinformatiques. ### Comparaison de kits de séquençage Le Q-score peut également être utilisé pour comparer les performances de différents kits de préparation d'échantillons ou de conditions expérimentales, offrant une mesure standardisée de la qualité des lectures. ### Optimisation des protocoles En surveillant les Q-scores, les chercheurs peuvent ajuster les protocoles de séquençage pour optimiser la qualité des données produites. ## Analyse Analyse du gène TTR à partir d'un amplicon de 1F à 4R (7096 paires de bases). C'est toutes les régions codantes et introns du gène TTR (Transthyretin). Ces résultats sont pris de 1 pod5 parmis les 48 (Mingon de nanopore (NATIF)) réalisés avec le modèle hac\@5.0.0 et le kit SQK-NBD114-24. Pour obtenir ces différents résultats nous avons modifié le qscore au moment du basecalling. Toutes ces valeurs nous laissent à penser que le qscore réglé aux alentours des 17 permettent d'avoir des résultats fiables sans perte de profondeur. A voir si celà change sur tout le séquençage (les 48 pod5). ```bash /home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dorado basecaller \ -x "cuda:0" \ --min-qscore 7 \ --no-trim \ --emit-fastq \ /home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dna_r10.4.1_e8.2_400bps_hac@v5.0.0 pod5/ | \ /home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dorado demux \ --kit-name SQK-NBD114-24 \ --emit-fastq \ --output-dir demultiplexed ```
DDNN° dossierEchantillonFCilluminaNanoporeProfondeur (x) c.13VAF(%) c.13 C>TProfondeur (x) c.371VAF(%)c.371 G>AilluminaNanoporeProfondeur (x) c.13VAF(%) c.13 C>TProfondeur (x) c.371VAF(%) c.371 G>A
25/12/19452023-3726RB16FLG-114RASRAS175024125811MinionRASRAS16441111467011
05/11/19422024-0849RB17FLG-114RASRAS268324195912MinionRASRAS27768122615911
13/11/19622024-0851RB18FLG-114POS/c.290C>APOS/c.290C>A1563241068112MinionPOS/c.290C>APOS/c.290C>A11817111020211
05/01/19472024-0882RB19FLG-114RASRAS131326100314MinionRASRAS1059911993410
01/11/19482024-0869RB20FLG-114RASRAS208529174912MinionRASRAS23943132244911
18/08/19842024-0325RB21FLG-114POS/c.290C>APOS/c.290C>A155623117112MinionPOS/c.290C>APOS/c.290C>A15205101334310
02/04/1970220691295RB22FLG-114POS/c.424G>APOS/c.424G>A154829137413MinionPOS/c.424G>APOS/c.424G>A15311131507911
16/03/1968203301144RB23FLG-114POS/c.424G>APOS/c.424G>A159525112810MinionPOS/c.424G>APOS/c.424G>A12567111163111

RB09 Gridion 1 seul bam (bam0)

## qscore 0
BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %
1 PODnullnull
9690872385
10666970776
11927995996
## qscore 9 (par défaut) | Barcode | Nbr Bases | 371 C > T % | Nbr Bases | 13 C > T % | 13 C > G % | | :------: | :-------: | :---------: | :-------: | ---------- | ---------- | | 1 POD | | | | | | | 9 | 620 | 6 | 659 | 7 | 4 | | 10 | 605 | 6 | 654 | 6 | 5 | | 11 | 811 | 7 | 859 | 6 | 5 | | Tous POD | | | | | | | 9 | 78 264 | 6 | 80 084 | 6 | 3 | | 10 | 77 604 | 6 | 81 460 | 6 | 3 | | 11 | 91 754 | 6 | 94 442 | 6 | 4 | ## qscore 14
BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %
1 PODnullnull
9562558953
10539658544
11711677045
Tous PODnullnull
96922257195653
106831257293153
118092958462953
## qscore 15
BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %
1 PODnullnull
9522556653
10523655944
11675674254
## qscore 17
BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %
1 PODnullnull
9436546553
10444545544
11567561943
Tous PODnullnull
95563655883542
105487055929142
116521856917143

RB10-Qscore17 bam merged

RB11-Qscore17 bam merged

## qscore 19
BarcodeNbr Bases371 C > T %Nbr Bases13 C > T %13 C > G %
1 PODnullnull
9246427143
10252626632
11306435144
## qscore 24 Il faut savoir que j'ai mis que 3 barcodes dans les tableaux du dessus mais en réalité j'en possède de 9 à 17 soit 9. Une fois le qscore passé à 24, j'ai perdu des barecodes et ils n'avaient presque pas de profondeur. Le qscore de 24 est donc trop élevé. *** Pour effectuer des tests de qualité, nous pouvons automatiser tout ce processus via un script en .sh. Un point d'entrée de POD5 et on en ressort les BAM qui sont rangé en fonction du barcode et du qscore. ```bash #!/bin/bash # Définir le chemin de l'exécutable Dorado DORADO_BIN="/home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dorado" MODEL_PATH="/home/grid/dorado-0.7.2-linux-x64/bin/dna_r10.4.1_e8.2_400bps_hac@v5.0.0" # Dossier contenant les données POD5 INPUT_DIR="pod5/" # Scores de qualité à tester QS_SCORES=(0 9 14 15 17 19 24) # Boucle sur chaque score de qualité for qscore in "${QS_SCORES[@]}"; do # Créer un répertoire pour les résultats de ce Q-score OUTPUT_DIR="demultiplexed_q${qscore}" mkdir -p "${OUTPUT_DIR}" # Basecalling et démultiplexage $DORADO_BIN basecaller -x "cuda:0" --min-qscore "$qscore" --no-trim --emit-fastq $MODEL_PATH $INPUT_DIR | \ $DORADO_BIN demux --kit-name SQK-NBD114-24 --emit-fastq --output-dir "${OUTPUT_DIR}" # Dossier pour stocker les fichiers BAM BAM_DIR="bam_files_q${qscore}" mkdir -p "${BAM_DIR}" # Convertir chaque fichier FASTQ en BAM for fastq in "${OUTPUT_DIR}"/*.fastq; do bam_file="${BAM_DIR}/$(basename "${fastq}" .fastq).bam" minimap2 -ax map-ont -t 8 ref_genome.mmi "${fastq}" | samtools sort -o "${bam_file}" done done echo "Basecalling, démultiplexage, et conversion en BAM terminés pour tous les Q-scores." ```